1-7-3- استخراج با آب داغ تحت فشار(PHWE) …………………………………………………………..34
1-7-4- استخراج با کمک اولترا سوند (UAE) و استخراج با کمک مایکروویو (MAE)…………36
1-8- مهمترین ترکیبات فعال زیستی استخراج شده از جلبک ها ………………………………………….37
1-8-1- آنتی اکسیدان ها ……………………………………………………………………………………………….37
1-8-2-فلاوونوییدها …………………………………………………………………………………………………….39
1-8-2-1- بیوسنتز فلاوونوئیدها ……………………………………………………………………………………..40
1-8-2-2- انواع فلاوونوئیدها …………………………………………………………………………………………41
1-9- لیپیدها …………………………………………………………………………………………………………………42
1-10- کربوهیدرات ها …………………………………………………………………………………………………..44
1-11- پپتیدها و پروتیین ها ……………………………………………………………………………………………44
فصل دوم مواد و روش ها46
2-2-آماده کردن محیط کشت BG-11 ……………………………………………………………………………50
3-2- نحوه خشک کردن نمونه ها ……………………………………………………………………………………53

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

2-3- تهیه عصاره متانولی گیاهان …………………………………………………………………………………….53
2-4- تعیین فلاونوئید کل ……………………………………………………………………………………………….54
فصل سوم نتایج59
3-1- نتایج حاصل از سنجش فلاوونوئید کل …………………………………………………………………….60
3-2- نتایج حاصل از سنجش فعالیت روبش رادیکال DPPH …………………………………………….62
3-3- نتایج حاصل از سنجش بتا کارتنوئید ……………………………………………………………………….63
3-4- نتایج حاصل از آنالیز آماری ……………………………………………………………………………………64
بررسی نمودار ………………………………………………………………………………………………………………..72
3-4- تفسیر نتایج …………………………………………………………………………………………………………74
فصل چهارم بحث نتیجه گیری و پیشنهادات76
نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………………..86
پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………….88
فهرست منابع89
منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………….89
منابع لاتین …………………………………………………………………………………………………………………….91
جداول
جدول2-1- مواد تشکیل دهنده محیط کشت Chu…………………………………………………………………….48
جدول2-2- مواد تشکیل دهنده محیط کشت BG-11………………………………………………………………. 51
جدول 3-1- نتایج حاصل از سنجش فلاوونوئید کل ……………………………………………………………….. 60
جدول3-2- نتایج حاصل از فعالیت روبش رادیکال DPPH …………………………………………………….. 61
جدول3-3-جداول مربوط به آنالیز آماری t-test ……………………………………………………………………… 62
نمودارها
نمودار3-1- نمودار کوئرستین سنجش فلاوونوئید کل …………………………………………………………….. 61
نمودار3-2- نمودار کوئرستین سنجش فعالیت روبش رادیکال DPPH ……………………………………… 62
نمودار3-3-میانگین فعالیت روبش رادیکال DPPH ……………………………………………………………….. 63
نمودار3-4- میانگین جذب آنتی اکسیدان ………………………………………………………………………………. 72
نمودار3-5- میانگین جذب روبش رادیکال DPPH………………………………………………………………… 73
اشکال
تصویر 1-1- شکل شماتیک برای استخراج سیال فوق بحرانی ………………………………………………… 30
تصویر1-2- شکل شماتیک برای استخراج با مایع تحت فشار………………………………………………….. 33
تصویر 1-3- دستگاه تابش اولترا سونیک/مایکرویو ………………………………………………………………… 36
چکیده:
جلبک ها و ریز جلبک ها به عنوان منابع اصلی ترکیبات غذاهای عملکردی مورد استفاده قرار گرفته اند.و این جلبک ها به عنوان اهداف کلیدی برای دستیابی به ترکیبات فعال زیستی مطرح هستند. ترکیبات موجود در این جلبک ها می توانند فعالیت ضد فشار خون بالا، اثرات کاهشی بر روی کلسترول، خواص آنتی اکسیدانی یا اثرات تنظیمی بر روی اشتها داشته باشند که به صورت تجاری هم عرضه می شود. از بین ریز جلبک ها Chlorella Vulgaris یکی از مواد ی است که بیشترین تحقیقات علمی در مورد آن انجام شده است واولین ریز جلبکی بود که به طور گسترده به عنوان منبع غذایی کشت شد. این ریز جلبک سبز تک سلولی دارای ارزش غذایی بالا شامل پروتیین ها، کربو هیدرات ها، لیپیدها، کارتنوییدها، آنتی اکسیدان، ترکیبات محرک ایمنی، ویتامین ها، پلی ساکارید، مواد معدنی، عامل منحصر بفرد CGF (فاکتور رشدکلرلا) است هرگاه یافتن نوع به خصوصی از ریزجلبکها با خصوصیاتی ویژه از خاستگاه و محیط های طبیعی آنها موردنظرباشد باید به روشهای غربالگری متوسل شویم گام اول در جداسازی یک ریزجلبک از خاستگاه طبیعی آن، انتخاب نوع محیط زیست ریزجلبک با شرایطی ویژه بر اساس اهداف نهایی تحقیق است. مرحله اصلی و مهم در غربالگری ایجاد یک کشت خالص است. به عبارت دیگر در این مرحله تلاش می شود نمونه مشخصی از ریزجلبک که فاقد هر نوع ارگانیسم دیگری از جمله باکتری، قارچ، پروتوزوا و غیره باشد، موردکشت قرارگیرد. در مطالعه حاضر نمونه ها به طور مکرر از مناطق مختلف همچون عباس آباد شازند، خنداب، سراب گیان نهاوند و میادین مختلف شهر اراک جمع آوری شد و با واکشت های مختلف در دو محیط کشت مایع و جامد Chu خالص سازی نمونه ها انجام شد.سپس نمونه های جلبکی Chlorella طی مراحلی خشک شد و فرایندهای مربوط به عصاره گیری انجام شد. و مقادیر فلاوونوئید، بتاکاروتنوئید، فعالیت آنتی اکسیدانی سنجیده شد و با استفاده از نرم افزارspss داده ها مورد ارزیابی و آنالیزقرار گرفت. نتایج واکشت های مختلف بهترین شرایط برای رشد Chlorella را در محیط کشت Chu به دست آورد. نتایج جذب با دستگاه اسپکترو فتومتری مقدار 67/494میلی گرم بر میلی لیتر اسید آسکوربیک ، 447/0بتا کاروتنوئید و مقادیر بسیار اندکی از فلاوونوئیدها را برای Chlorella Vulgaris تعیین کرد. مطالعه ای که توسط Wang و همکارانش در سال 2010 انجام شد مقادیر بالایی از لیپید ها و کارتنوئید ها را در جلبکChlorella vulgaris تعیین کرد اما مقدار فلاوونوئید حاصل در این مطالعه بسیار ناچیز بود (019/0) که نتایج مطالعه حاضر را تآیید می کند که ممکن است به دلیل روش های مختلف کشت و نوع حلال های به کار رفته در این بررسی باشد وبرای تعیین مقادیر ترکیبات زیستی به ویژه فلاوونوئیدها روش های استخراج پیشترفته تر و تغییر در شرایط کشت را پیشنهاد می کند.
کلمات کلیدی: Chlorella vulgaris ، محیط کشت Chu و BG-11 فلاوونوئید، بتا کارتنوئید، آنتی اکسیدان
مقدمه
وقوع و شیوع بیماری های مختلفی همچون سرطان، بیماری های قلبی-عروقی، چاقی، و دیابت ممکن است مربوط به رژیم غذایی پر کاری و ترکیبی از سبک زندگی بی تحرک باشد. مفهوم غذاهای عملکردی1 اولین بار در ژاپن ظاهر شد جایی که این مفهوم به عنوان وسیله ای برای افزایش سلامتی و سالم زیستن در نظر گرفته شده بود. این مفهوم سپس در کشور های اروپایی به میزان زیادی توسعه یافت.محیط دریا که شامل تنوعی از موجودات با خواص زیستی بی نظیر است یکی از عمده ترین منابع غذایی برای دستیابی به مفهوم غذاهای عملکردی می باشد. تا این تاریخ جلبک ها و ریز جلبک ها به عنوان منابع اصلی ترکیبات غذاهای عملکردی مورد استفاده قرار گرفته اند.و این جلبک ها به عنوان اهداف کلیدی برای دستیابی به ترکیبات فعال زیستی مطرح هستند (Ibañez , et al,2012).
جلبکها گروه بزرگی از گیاهان هستند که از لحاظ شکل و اندازه ، تنوع وسیعی دارند. برای اولین بار ، لینه2 گیاه شناس ، در سال 1754 ، این گیاهان را با نام آلجی معرفی کرد. رومیها از واژه fucus ، چینیها از واژه tsao و مردم هاوایی از واژه limo برای معرفی این گیاهان استفاده می‌کردند. در تقسیمات جهانی گیاهی ، جلبکها 1800 جنس و 21000 گونه دارند. بیشتر جلبکها ، آبزی هستند. در جلبکها هر سلول دارای 1 تا 2 عدد کلروپلاست و بندرت دارای کروماتوفور هستند. در جلبکها ساختارهای تولید مثلی بطور کامل به هاگ یا گامت تبدیل می‌شوند. جلبکها یا یوکاریوت یا پروکاریوت هستند. تولید مثل در جلبکها به دو طریق جنسی و غیر جنسی صورت می‌گیرد. جلبکها فاقد هر نوع منفذ یا روزنه هستند و ریزوئیدها در آنها در صورت وجود بسیار ساده است. اندامهای جنسی در جلبکها تک سلولی یا پرسلولی است . ذخیره غذایی در جلبکها ، نشاسته است و به صورت اتوتروف زندگی می‌کنند و دیواره سلولی در آنها از سلولز تشکیل شده است.
ترکیبات موجود در این جلبک ها می توانند فعالیت ضد فشار خون بالا، اثرات کاهشی بر روی کلسترول، خواص آنتی اکسیدانی یا اثرات تنظیمی بر روی اشتها داشته باشند که به صورت تجاری هم عرضه می شوند.جلبک ها یک گروه ناهمگن و پیچیده از موجوداتی را تشکیل می دهند که به واسطه ماهیت فتوسنتتیک3 آنها و ساختارهای ساده تولید مثلی شناخته شده اند. جلبک ها بر اساس اندازه خود می توانند به دو گروه موجودات تک سلولی با عنوان میکرو جلبک ها4 و موجودات پرسلولی با نام ماکروجلبک هاشناخته می شوند. جلبک ها به طور فراوانی در محیط های با میزان زیادی از نور، نمک و دما زندگی می کنند. به منظور سازگاری با این شرایط حاد بیشتر جلبک ها دامنه متنوعی از متابولیت های 5ثانویه راتولید می کنند که اغلب فعالیت های زیستی بالقوه ای دارند. کشت یا تولید اکثر جلبک ها در مقیاس صنعتی ساده است. بنابراین تولید ترکیبات فعال زیستی مشتق از جلبک ها ممکن است توسط انتخاب شرایط کشت مناسب تنظیم شود. نحوه به دست آوردن ترکیبات زیستی از میکرو و ماکروجلبک ها به عنوان یک منشأ جدید از اهمیت زیادی برخوردار است. در این رابطه یک نیاز اساسی برای ترکیب مناسب، انتخاب، هزینه مؤثر و روشهای استخراج مناسب و سازگار با محیط زیست با در نظر گرفتن ملزومات قانونی برای حلال های مناسب غذایی و روش های صحیح وجود دارد( .(Sharma ,et al 2012 در مطالعه حاضر نمونه برداری جلبک Chlorella vulgaris از مناطق مختلفی همچون عباس آباد شازند، خنداب، پارک های ملایر، سراب گیان نهاوند و میدان شریعتی شهر اراک انجام شد و سپس نمونه ها برای انجام خالص سازی با استفاده از واکشت های مختلف به آزمایشگاه منتقل شد برای رشد این جلبک از محیط کشت های جامد و مایع Chu و BG-11استفاده شد. و مقادیر فلاوونوئید ، کاروتنوئید و فعالیت آنتی اکسیدانی با استفاده از فعالیت روبش رادیو اکتیو سنجیده شد و آزمایش ها در سه تکرار انجام شد در نهایت با استفاده از نرم افزار SPSS نتایج آماری تجزیه و تحلیل شد.
اهداف
هدف از مطالعه حاضر شامل جمع آوری جلبکها شناسایی خصوصیات تاکسونومیکی جنس با استفاده از کلیدهای شناسایی معتبر، تهیه محیط کشت و انتخاب محیط کشت موثر، جداسازی و خالص سازی جنس chlorella، شناسایی و جداسازی ترکیبات فعال بیولوژیکی موجود در جنس(فلاوونوئید، بتاکارتنوئید، انتی اکسیدان(اسیدآسکوربیک))، است.
فصل اول
مروری بر منابع
1-مروری بر منابع
1-1-ریز جلبک ها
ریز جلبک ها کارخانه های سلولی هدایت شده با نور خورشید هستند که دی اکسید کربن را به سوخت های زیستی بالقوه ، غذا و ترکیبات فعال زیستی با ارزش بالای غذایی تبدیل می کنند. این جلبک ها در مقایسه با فرآورده های رایج غذایی، بهره وری بیشتر، محتوای لیپید و پروتیین نسبتا بالایی دارند و به زمین های مزروعی و آب تازه وابسته نیستند. در دهه گذشته بیوتکنولوژی ریز جلبک ها یک گزینه قابل توجه برای به دست آوردن غذا و مولکولهای زیستی متشکل از پروتیین ها، ویتامین ها، رنگدانه ها، اسیدهای چرب غیر اشباع چندگانه 6و موادی با فعالیت های ضد توموری و تعدیل کننده سیستم ایمنی بوده است. برخی از فواید ریز جلبک ها شامل کنترل فشار بالا، درمان کولیت7 اثرات آنتی توموری است. (Yusof, et al, 2013) امروزه علاقمندی زیادی در رابطه با تولید لیپیدها از انواع ریز جلبک ها وجود دارد. از لحاظ تئوری ریز جلبک ها قادر به تولید مقادیر بالاتری از لیپید نسبت به دیگر محصولات مرسوم هستند بنابراین منبع بالقوه ای برای سوختهای زیستی به شمار می روند. همچنین مشخص شده که ریز جلبک ها دارای مقادیر بالایی از آنتی اکسیدان های8 طبیعی هستند. این ریز جلبک ها به دلیل غنی بودن لیپید هایشان از اسید های چرب امگا-39 با زنجیره بلند 10EPAو DHA11 می توانند منبع قابل ملاحظه ای از اسید های چرب تغذیه ای در مقایسه با روغن ماهی فراهم آورند. ریز جلبک ها میکرو ارگانیسم هایی فتوسنتتیک هستند که انرژی نوری، آب و دی اکسید کربن را به توده زیستی جلبک تبدیل می کنند. اصول کشت ریز جلبک ها مشابه کشت در باکتریها، قارچها و مخمرهاست، تنها از لحاظ ترکیبات محیط کشت و جنبه فتوسنتتزی از هم متمایزند. ریز جلبک ها به طور ویژه ای در تبدیل انرژی خورشیدی مؤثر هستند. چندین گونه از ریز جلبک ها غنی از روغن هستند، محتوای روغنی برخی ریز جلبک ها حدود 80% وزن خشک آنها در شرایط محصول کامل است. ریز جلبک ها شامل دو نوع، لیپیدهای خنثی و لیپیدهای قطبی هستند. فسفولیپیدها و گلیکولیپیدها، لیپیدهای قطبی هستند فسفولیپیدها در ساختار غشایی تجمع یافته اند و گلیکولیپیدها در غشای اندامک های فتوسنتز کننده به طور غالب وجود دارند. لیپیدهای خنثی به طور ویژه شامل مونو ، دی و تری اسیل گلیسرول هستند. این لیپیدها به دنبال یک کمبود در اندامک هایی نظیز کلروپلاست ذخیره می شوند. اسیدهای چرب غیر اشباع به ندرت در سلول به صورت آزاد یافت می شوند بلکه عمدتا در ذخایر لیپیدی همچون تری گلیسریدها قرار دارند. ریز جلبک ها از فتوسنتز برای تثبیت دی اکسید کربن با استفاده از آنزیم Rubisco استفاده می کنند.Plaza, et al,2009, Liang, et al, 2009.sharma,2012)).
1-1-1-شرایط رشد ریز جلبک ها
رشد جلبک تحت تأثیر فاکتور های متعددی همچون ریز مغذی ها، شوری، pH، دما و نور(شدت و مدت زمان) است.در بین این عوامل، نور که به طور مستقیم مکانیسم فتوسنتز را تحت تأثیر قرار می دهد یک عامل مهم در تعریف شرایط مناسب برای کشت است. فتوسنتز فیتوپلانکتون ها توسط فاکتور های طبیعی همچون دما و پرتودهی کنترل می شود. این فاکتورها ارزش غذایی فیتوپلانکتون ها همچون پروتیین، لیپید، کربوهیدرات، اسید های آمینه و ترکیبات رنگدانه دار را متأثر می کنند. مطالعات، اثرات پرتودهی و دوره نوری روی توده زیستی و ترکیب اسید های چرب Chlorella vulgaris را بررسی کرده اند. مدت زمان زیادی است که اثرات زیان آور تابش مستقیم نور بر روی کشت جلبک مشخص شده است. تحت شرایط کشت طبیعی شعاع مستقیم نور خورشید بندرت روی جلبک قرار می گیرد و موقعیت قرار گیری آن چند سانتیمتری داخل آب برای کاهش اثرات مضر کافی است. در زیستگاه های طبیعی جلبک ها به طور غالب در نور کاهش یافته رشد می کنند از اینرو برای اجتناب از تابش مستقیم نور کشت بایستی در پنجره قرار بگیرد.( Ryckebosch, et al,2011).
1-2-تاریخچه Chlorella Vulgaris
Chlorella یکی از قدیمی ترین گیاهان روی کره زمین است. Chlorella بالاترین میزان کلروفیل را در بین گیاهان شناخته شده جهان دارد که همین خصوصیت باعث ایجاد رنگ سبز تیره آن شده است . نام Chlorella بر گرفته از ,واژه یونانی « chloros » به معنی سبز وپسوند لاتین «ella» به معنی کوچک می باشد. با وجود اینکه Chlorella از زمان آغاز حیات بر روی کره زمین وجود داشته است و کشف آن به سال 1890  بوسیله میکرو بیولوژیست آلمانی به نام M.W.Beijerinck   بر می گردد ولی تا سال1940 بطور جدی مورد مطالعه قرار نگرفت. و پروفسور Beijerinck  برای اولین بارChlorella را در آزمایشگاه شخصی اش پرورش داد بیوشیمیست و فیزیولوژیست سلولی آلمانیOtto Heinrich Warburg در سال 1931 برای مطالعه بر روی تنفس سلولی همچنین بررسی فتوسنتز Chlorella موفق به دریافت جایزه نوبل شد و در دهه 1940 ژاپنی‌ها شروع به مطالعه وسیع‌تری درباره آن کردند. شهرت امروزهChlorella بیشتر مرهون تلاش آن‌ها برای شناخت این جلبک است.
ژاپن برای اولین بار در جهان برای گسترش تکنولوژی پرورش Chlorella پیشگام شد. Chlorella به دلیل داشتن دیواره سلولی سخت و نفوذناپذیر ، در صورت مصرف مستقیم سلول غیر قابل استفاده و مواد مغذی داخل آن غیر قابل دسترس می باشد. فرایند منحصر به فرد شکستن دیواره سلولی این گیاه در حالیکه مواد مغذی داخل سلول دست نخورده باقی بماند اولین بار به وسیله یک شرکت ژاپنی با موفقیت انجام شد.(Simon,2000)
1-3- خواص Chlorella Vulgaris
از بین ریز جلبک ها Chlorella Vulgaris یکی از مواد ی است که بیشترین تحقیقات علمی در مورد آن انجام شده است ) واولین ریز جلبکی بود که به طور گسترده به عنوان منبع غذایی کشت شد. این ریز جلبک سبز تک سلولی دارای ارزش غذایی بالا شامل پروتیین ها،کربو هیدرات ها، لیپیدها، کارتنوییدها، آنتی اکسیدان، ترکیبات محرک ایمنی، ویتامین ها، پلی ساکارید، مواد معدنی، عامل منحصر بفرد 12CGF (فاکتور رشد کلرلا) است2009) . (Morris et al این ریز جلبک به عنوان یک غذای سالم، مکمل غذایی و همچنین در صنعت دارویی و آرایشی کاربرد دارد. به دلیل کامل بودن منابع غذایی Chlorella می توان آنرا به تنهایی به عنوان یک غذای کامل برای یک دوره طولانی استفاده نمود. محققان ناسا نیز در مورد استفاده از آن به عنوان غذای فضا نوردان در طول سفرهای فضایی تحقیقاتی داشته اند.
مکمل به دست آمده از این جلبک می تواند به صورت کپسول ،قرص، مواد افزودنی غذایی یا به صورت عصاره مایع مورد استفاده قرار بگیرد Chlorella vulgarisبه صورت تجاری به عنوان مکمل غذایی یا افزودنی به غذاهایی همچون حبوبات و یولاف عرضه شده است. (Yusof, et al 2012, Morris et al, 2009). گزارش های جدید حاکی از این است که مقادیر تولید Chlorella سالیانه به میزانه 2000 تن است. و توده زیستی آن در غنی سازی پروتیین غذاهای رایج و فرمولاسیون غذاهای عملکردی و مکمل های غذایی کاربردی است . اخیرا برخی از گونه های آن به عنوان منشأ سوخت های دیزلی شناسایی شده اند. مشخصات لیپیدهای توده زیستی به دست آمده از این جنس نشان داده که Chlorella vulgaris به عنوان ماده خام برای سوخت های زیستی مناسب است. جلبک های سبز یکی از گروه های عمده تاکسونومیکی13 هستند که کاربرد عمده آنها به عنوان منبع تولید سوخت های زیستی به علت غنی بودن آنها از لیپید است و به عنوان منبع ضروری اسیدهای چرب برای تغذیه انسانی و حیوانی به شمار می رود.
یکی از روش های تحقیقی عمده ارزیابی Chlorellaبه عنوان منبع تولید پروتیین بوده است اماChlorella یک دیواره سلولزی قوی دارد و پروتیین حاصل از آن نتایج ضعیفی خواهد داشت. روش هیدرولیز آنزیمی به عنوان یک روش نوید بخش میزان هضم پروتیینی را افزایش داده است. .(Morris et a,2009)
1-4- رده بندی Chlorella
Chlorella یک جنس از جلبک های سبز تک سلولی است. شکل آن کروی و حدود 10-2 میکرومتر قطر دارد و فاقد تاژک می باشد. این ریز جلبک حاوی رنگدانه های فتوسنتزی سبز کلرو فیل a و b در کلروپلاست خودش است و از لحاظ سیستماتیکی متعلق به (سلسله Plantae، شاخه Chlorophyt، رده Trebouxiophyceae، راسته Chlorellales، خانواده Chlorellaceae، جنس Chlorella) است(Gonzalez, et al,2013). و گونه های آن شامل:
Chlorella minutissima
Chlorella autotrophica
Chlorella variabilis
Chlorella pyrenoidosa
Chlorella vulgaris است.
1-5- Chlorella Vulgaris و مطالعات زیست پزشکی14
این ریز جلبک توجه قابل ملا حظه ای در برنامه های کاربرد ریز جلبک ها در تغذیه و زیست پژشکی به خود اختصاص داده است. و تأ ثیرات مثبت آن در مطالعات انسانی و جانوری در ژاپن و ایالات متحده شناخته شد. مطالعات نشان داه اند که این نوع جلبک باعث کاهش تکثیر و القا آپوپتوز15 دودمان سلول های سرطانی کبد می شود. مطالعات در بدن موجود زنده اثرات ضد توموری و ضد سمیتی این جلبک را آشکار ساخته است. همچنین بررسی ها نشان داده اند عصاره حاصل از این جلبک متاستاز ناشی ازتومور فیبروسارکومای موشی را سرکوب می کند.تحقیقات نشان داده عصاره به دست آمده ازChlorella vulgaris در مقایسه با دیگر جنس های ریز جلبک ها از محتوای آنتی اکسیدانی بیشتری برخوردار است.در مطالعات جانوری عصاره گرفته شده از Chlorella vulgaris اثرات ضد التهابی، ضد توموری و ضد کلسترولی را آ شکار ساخت. همچنین مشخص شده است که عصاره Chlorella vulgaris باعث القا آپوپتوسیس می شود. بنابراین گونه های ریز جلبک ها به ویژه Chlorella vulgaris می تواند برای توسعه فرآورده های آنتی اکسیدانی و ضد سرطانی سودمند باشد. ( Wang, et al,2010) عصاره استخراج شده با آب داغ حاصل از Chlorella vulgaris باعث تخریب DNA و القا آپوپتوسیس در سلولهای سرطانی کبد می شود(Yusof, et al,2012 (. در مطالعه ای اثر عصاره Chlorella بر روی بیان پروتیین های تنظیمی آپوپتوسیس در موش های صحرایی القا شده با سرطان کبد به اثبات رسیده استAzamai, et al,2010) ( .
برخی از تحقیقات اثر Chlorella بر روی پوست را به اثبات رسانده اند به طوری که مشخص شده Chlorella اثرات ضد کلاژناز16 و ضد الاستاز و یک اثر تحریکی بر روی سنتز کلاژن دارد Chlorella باعث افزایش بیان elafin شده و بنابر این از تخریب الاستین جلوگیری می کند همچنین نشان داده شده که Chlorella بر روی پروتیین های اتصالی اپیدرمی دارای اثرات مثبتی است. این نوع ریز جلبک پوست را از اثرات سیستم ایجاد کننده رادیکال های آزاد و در نتیجه پیر شدن پوست حظ می کند.(Smiley, et al,2005).
1-6- روش های غربالگری17، خالص سازی و شناسایی ریز جلبک ها
با توجه به اهمیت روزافزون ریزجلبکها و به دلیل کاربردهای فراوان آنها در تولید غذای انسان و دام و همچنین به علت ترکیبات ارزشمندی که تولید می کنند، در اینجا لازم است روشهای متداول درجداسازی، شناسایی و کشت این میکروارگانیسمها مختصراً مورد بحث قرارگیرد. Prescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-1- روشهای تهیه ریزجلبکها
به طورکلی، جهت به دست آوردن سویه های ریزجلبکی دو راهکار اصلی دنبال می شود. در راهکار اول جنس، گونه و حتی سویه ثبت شده در کلکسیونهای معتبر دنیا را سفارش داده و خریداری می کنند و در راهکار دوم، با استفاده از روشهای غربالگری این قبیل موجودات از طبیعت جداسازی، خالص سازی و مورد شناسایی قرارمی گیرند. Prescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-1-1-خریداری ازمراکز فروش ریزجلبکها
فهرستی از مراکز معتبر عرضه و فروش ریزجلبکها به همراه آدرس اینترنتی آنها در پیوست آمده است. این مراکز، انواع مختلفی از ریزجلبکهای شناسایی شده و خالص را ارائه می دهند. با سفارش و خریداری از این کلکسیونها که در آنها هر سویه با کُد و شماره ای مشخص می شود می توان منبع کاملاً خالصی از ریزجلبکها را در اختیار گرفت. کلکسیون جلبکها و سیانوباکتریهای دانشگاه تورنتو کانادا یکی از معتبرترین این مراکز است که با داشتن بیش از 500 جنس و گونه مختلف (UTCC)18 ریزجلبکی به صورت کشت مایع و جامد، سویه های مورد نیاز را در اختیار محققین قرارمی دهد. در ایران هم پارک علم و فن آوری خلیج فارس اقدام به جمع آوری و کشت سویه های مختلف جلبکی کرده و به مطالعه محققین می تواند سودمند باشدPrescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-2-غربالگری
هرگاه یافتن نوع به خصوصی از ریزجلبکها با خصوصیاتی ویژه از خاستگاه و محیط های طبیعی آنها موردنظرباشد باید به روشهای غربالگری متوسل شویم. به عنوان مثال اگر هدف، پیداکردن سویه ریزجلبکی موثر بر آلاینده های محیط زیست باشد یکی از روشهای توصیه شده آن است که در محل آلودگی با آلاینده به جستجوی ریزجلبکهای مقاوم یا تجزیه کننده آن بپردازیم. مرحله پس از یافتن سویه، خالص سازی، شناسایی و کشت بهینه آن در محیط آزمایشگاهی خواهد بود. بررسی چگونگی و میزان حذف آلاینده های طبیعی توسط سویه غربال شده در مرحله بعدی قراردارد. غربالگری به طور عمده در چند مرحله انجام می گیرد که در ادامه بحث می شود(2008.( Jhon DM et al, 2002, Shokravi
1-6-2-1-غربالگری از خاستگاههای طبیعی
گام اول در جداسازی یک ریزجلبک از خاستگاه طبیعی آن، انتخاب نوع محیط زیست ریزجلبک با شرایطی ویژه بر اساس اهداف نهایی تحقیق است. به عبارت دیگر، جستجو در زیستگاههای مناسب به منظور افزایش احتمال یافتن نوع خاصی از ریزجلبک، مراحل بعدی بخصوص مرحله خالص سازی یک سویه با ویژگی های مطلوب را آسانتر می سازد. به طور عمده، نمونه های خاک و آب ممکن است از مناطق مختلفی مانند چشمه های آب گرم، یخهای قطبی، فاضلابهای صنعتی، شالیزارها19 و بسیاری از زیستگاههای دیگر جمع آوری شوند. بنابراین با توجه به هدفی که در نظرگرفته می شود، زیستگاه مناسب جهت جداسازی ریزجلبکها انتخاب می گردد. مثلاً اگر هدف جداسازی یک گونه سرمادوست باشد می توان نمونه را از زیستگاههایی نزدیک مناطق سردسیر تهیه کرد. در مواردی نمونه های حاوی ریزجلبکها جمع آوری شده باید فیلترشوند و در مواردی نیز نمونه مستقیماً و بدون نیاز به انجام مرحله اضافی جهت جداسازی و غربالگری، مورد استفاده قرارمی گیرند. در مواردی که گونه های ریزجلبکی به صخره ها و پوسته صدف ها چسبیده اند باید با تراشیدن، آنها را از سطوح جدا نمود Shokravi ,et al,2007, Bellinger, et al 1992 )).(اسماعیلی ساری و همکاران، 1379).
1-6-3- غنی سازی محیط کشت
در این روش، شرایط مناسب جهت رشد و تکثیر یک گروه خاص مثلاً ریزجلبکهای فتوسنتزکننده فراهم می شود؛ درحالیکه در آن شرایط سایر ریزجلبکها رشدنمی کنند. مثلاً برای جداکردن یک ریزجلبک فتوسنتزکننده از خاک ابتداء 5 تا 10 میلی گرم از نمونه خاک را به 5/2 تا 3 میلی لیتر از محیط کشت مناسب جهت رشد ریزجلبکها اضافه می کنیم و به مدت 3 هفته آنها را در پلیت های میکروبیولوژی، در دمای25 درجه سانتیگراد نگهداری می کنیم. در صورت نوردهی مناسب به همراه دمیدن هوای حاوی 5 درصد دی اکسیدکربن، پس از طی مدت زمانی، آثار رشد ریزجلبکهای موجود قابل مشاهده خواهد بود. سلولهای رشدیافته در پلیت های اولیه را در مرحله بعد به پلیت های جدیدی منتقل می کنیم تا ریزجلبک هدف جداسازی گردد. محیط کشت حاوی املاح و آگار برای جداسازی انواع فتوسنتزکننده و محیط کشت حاوی یک ترکیب آلی کربندار برای رشد انواع میکسوتروف20 قابل استفاده خواهد بود. به دنبال چند مرحله تکرار روند مذکور و تعویض محیط کشت، در نهایت به جداسازی و خالص سازی یک سویه مشخص از ریزجلبکها خواهیم رسید. در مواردی که نمونه های آب حاوی ریزجلبکها مورد نظر باشد یک تیمار اولیه ضروری است. در این حالت، با عبوردادن نمونه ازصافی مناسب و به دنبال آن شستشوی توده سلولی پشت صافی با آب مقطر استریل، باقیمانده به محیط حاوی آگار اضافه می شود. پس از2 الی3 هفته انکوباسیون در شرایط نوری و دمایی مناسب، کلنی های پدیدارشده به صورت استریل به محیط مایع و استریل منتقل می گردند تا توده زیستی کافی ایجاد گردد. . (Bellinger, et al,1992)
1-6-4- جداسازی مستقیم
در این روش به کمک میکروپیپت یا فیلدوپلاتین سلولهای تکی و یا رشته های تشکیل شده ازریزجلبک هدف از خاستگاه طبیعی آن برداشت شده و بر سطح یک پلیت آگاردار انتقال می یابد. در یک روش مشابه، به کمک نوعی دستگاه اسپری کننده، نمونه برداشته شده از منبع اولیه به صورت قطرات بسیار ریز روی سطح پلیت اسپری می گردد. پس از انکوباسیون، تک کلونیهای پدیدآمده از سطح آگار برداشته شده و به محیط کشت مایع منتقل می گردند. (Bellinger, et al,1992)
1-6-5- تولید کشت خالص
مرحله اصلی و مهم در غربالگری ایجاد یک کشت خالص است. به عبارت دیگر در این مرحله تلاش می شود نمونه مشخصی از ریزجلبک که فاقد هر نوع ارگانیسم دیگری از جمله باکتری، قارچ، پروتوزوا و غیره باشد، موردکشت قرارگیرد. از جمله روشهایی که به این منظور استفاده می شود می توان به موارد زیر اشاره کرد.
استفاده از جهت تابش نور: ریزجلبکها به دلیل تمایل بالایی که به نور دارند در معرض نور مناسب تجمع می یابند. البته ذکراین نکته نیز ضروری است که شدت بالای نور امکان ایجادآثار معکوسی نظیر دوری گزینی ریزجلبکها از نور را سبب می شود که در این صورت رشدی مشاهده نمی گردد. در صورت استفاده از روش تیمار نوری، در ظروفی کاملاً پوشیده و تاریک،منفذی باریک جهت تابش نور ایجادمی کنیم. در این صورت فقط دستهای از ریزجلبکها خصوصاً انواع تاژکدار به سمت منفذ نورانی حرکت می کنند و در حوالی آن تجمع مییابند که می توان آنها را به کمک یک پیپت از مناطق مذکور جمع آوری نمود. به دلیل افزایش تراکم سلولهای فتوسنتزکننده در آن مناطق، مراحل بعدی خالص سازی راحت تر و سریعترانجام خواهدشد . (Bellinger, et al,1992 )

1-6-5-1- شستشوی سلول: یکی از علل آلودگی، چسبیدن و اتصال سلولهای دیگر به ریزجلبک مورد نظراست. در این روش، پس از برداشت سلولهای ریزجلبک اولیه به کمک یک میکروپیپت آن را چندین بار به محیطهای مایع و استریل وارد میکنند. تکرار این عمل به محیط کشت تازه و کشیدن مجدد آن می تواند سایر میکروارگانیسمهای آلوده کننده را حذف کند. (Bellinger, et al, 1992)
1-6-5-2- رقیق سازی سریالی21 : این روش که بطور معمول جهت خالص سازی باکتریها بکارمی رود،براساس شانس و احتمال حضور یک میکروارگانیسم خاص در رقت های بسیار پایین پایه گذاری شده است. برای انجام آن، ابتدا محیط های مایع و استریلی که مخصوص رشد ریزجلبک هدف است فراهم می گردد. نمونه مورد نظر پس از طی مراحل اولیه آماده می شود و به اولین لوله حاوی محیط کشت مایع انتقال می یابد. حجم معینی (مثلاً 2 میلیلیتر) از لوله اول حاوی میکروارگانیسم به لوله بعدی افزوده می شود. پس از همزدن و مخلوط کردن، مجدداً همان حجم معین از لوله دوم به لوله سوم منتقل می گردد تا به آخرین لوله که بالاترین رقت از ارگانیسم هدف فراهم شده باشد این عمل تکرارمی شود. مقادیر مشخصی از مایع درون لوله ها به پلیتهای حاوی آگار و محیط کشت اختصاصی ریزجلبک منتقل می شود و فرصت و شرایط لازم جهت رشد آنها فراهم می گردد. در این صورت احتمال حضور میکروارگانیسم آلوده کننده کمتر خواهدبود. این عمل احتمال خلوص ریزجلبک منتخب را افزایش می دهد. . (Bellinger, et al ,1992)
1-6-5-3- سانتریفوژ شیب چگالی22 : در صورت ایجاد یک محدوده شیب چگالی به کمک ترکیباتی ویژه و با استفاده از یک سانتریفوژ، امکان جداسازی ریزجلبکها از نمونه وجود دارد. از آنجا که چگالی مربوط به سلولهای ریزجلبکی در مقایسه با باکتریها متفاوت است با استفاده از این تکنیک می توان ریزجلبکها را از باکتریها جدا نمود. در یکی از این روشها از ترکیب سیلیکاسل پرکول 23 به جهت ایجاد شیب چگالی و متعاقب آن، جداسازی ریزجلبکها استفاده می شود.
1-6-5-4- تابش نور ماوراء بنفش: اغلب جلبکها در مقایسه با باکتریها مقاومت بیشتری در برابر تابش نورUV از خود نشان می دهند. بنابراین به دنبال تاباندن اشعه UVسپس شستشو، رقیق سازی نمونه و اسپری کردن بر سطح یک محیط انتخابی حاوی آگار احتمال بدست آوردن یک کشت خالص از ریزجلبک بالا می رود (. (Kuzmina, et al, 2004
1-6-5-5- صاف کردن: جلبکهای بزرگ و ریزجلبکهای رشته ای را می توان به کمک یک فیلتراسیون ساده از باکتریها جداسازی نمود. رشته های جداشده را می توان با استفاده از دستگاه سونیکاتور به رشته هایی با طول کمتر (3 تا 5سلول) تبدیل نمود و سپس نمونه های رقیق شده در پشت فیلتر را به محیط کشت مناسب منتقل کرد(. (Kuzmina, et al, 2004
1-6-5-6- استفاده از آنتی بیوتیکها: چندین نوع آنتی بیوتیک به طور مؤثر در حذف آلودگی باکتریایی از جلبکها مورد استفاده قرارگرفته اند. مثلاً محیط آگاردار حاوی ایمیپنم24 به میزان( 100 میکروگرم در میلی لیتر) جهت خالص سازی ریزجلبکهای یوکاریوتی و همچنین تک سلولی بکارمی رود.( نیستا نین25 به میزان 100 میکروگرم در میلی لیتر) و نیز سیکلوهگزیمید برای حذف آلودگیهای قارچی و خالص سازی انواع سیانوباکتریها بکارمی رود . (Kuzmina, et al, 2004)
1-6-6- شناسایی ریزجلبکهای جداشده
مرحله پس از غربالگری اولیه، جداسازی و خالص سازی ریزجلبکها از نمونه های محیطی، شناسایی آنها است. شناسایی اولیه شامل تهیه اسلاید و مشاهده میکروسکوپی می باشد. پس از تهیه اسلایدها مانند آنچه که در روشهای میکروبیولوژی انجام می گیرد از اضافه کردن گلیسیرین هنگام قراردادن لامل روی لام و روش مشاهده مستقیم نمونه توسط میکروسکوپ استفاده می شود. برای مشاهده غلاف اطراف سلولها می توان از روش رنگ آمیزی لوگل استفاده کرد. در صورتی که برای مشاهده میکروسکوپی ریزجلبکها لازم باشد از حرکت سریع آنها جلوگیری کنیم، میتوان از فرمالین 4 درصد یا محلول )فرمالین، اسیداستیک، الکل (جهت تثبیت یا بی تحرک سازی استفاده نمود. در مرحله مقدماتی شناسایی ریزجلبکها از ویژگیهای مورفولوژی یا ظاهری آنها استفاده می شود. منابع معتبر متعددی جهت بررسی کلیدهای شناسایی جلبکها وجود دارند که از میان آنها می توان به کتب بلینگر 2 اشاره کرد ( Bellinger, et al 1992).
1-6-6-1- شناسایی ریزجلبکها به کمک آنالیز مولکولی 18S rDNA
از آنجا که به دلیل تنوع بسیار زیاد گونه های ریزجلبکی ممکن است روشهای معمول مانند مشاهده میکروسکوپی و مطالعات مورفولوژی در شناسایی آنها کافی نباشد و از طرفی با توجه به پیشرفت روزافزون روشهای بیولوژی مولکولی و سرعت بالا و همچنین اطمینان و راحتی شناسایی آنها از طریق مقایسه ژنهای محافظت شده26 3 در سطح جنس و گونه ریزجلبکها، رویکرد استفاده از آنالیزمولکولی 18S rDNA روشی مناسب خواهد بود. در دهه های اخیر روشهای آنالیز مولکولی در شناسایی میکروارگانیسمهای مختلف بر اساس بررسی توالی ژن کدکننده زیرواحدهای سازنده RNA های ریبوزومی گسترش قابل توجهی یافته است. ناحیه کدکننده ژن16 S rDNA باکتریها به شدت حفاظت شده است و می توان توالی ژن کدکننده این بخش از ژنوم باکتری را پس از تکثیر به کمک تکنیک27 PCR توالی یابی کرد . با واردکردن این توالی در بانکهای جهانی ژن 28 میتوان ارگانیسم دارای آن توالی را شناسایی نمود. اخیراً همین روش در خصوص ریز جلبکهای یوکاریوتی با یافتن پرایمرهای 29مناسب جهت تکثیر ژن کدکننده18srDNA توسعه یافته است. برای این منظور ابتدا باید DNA ریزجلبک را استخراج نمود، ناحیه کدکننده ژن18SrDNA را با استفاده ازPCR تکثیرکرد و سپس توالی ژن را تعیین نمود.در مرحله نهایی با مقایسه این توالی در بانکهای جهانی ژنی، ریزجلبک مورد نظر با احتما ل بالایی شناسایی می شود. (Berad , et al,2005, Simon,etal,2000)
1-6-6-2- انجام عملیات BLAST جهت شناسایی سویه ریزجلبک
به منظور مقایسه میزان شباهت توالی ژن srDNA 18 حاصل از مراحل قبل با توالی ژن های موجود در بانک های جهانی ژن و شناسایی ارگانیسم مورد آزمایش عملیات BLAST انجام می گیرد. یکی از معتبرترین آنهاNCBI است به این منظور، با مراجعه به آدرس http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ وارد سایت شده و گزینه BLAST انتخاب می شود. با انتخاب گزینه Nucleotide BLAST و سپس واردکردن توالی مورد نظر و انتخاب کلیدBLAST فهرستی از ژن های مشابه با ژن هدف و نام ارگانیسمهای مربوطه مشاهده می گردد. در نهایت، توالی این ژن با توالیهای موجود در بانک ژن مقایسه و ارگانیسم هدف مورد شناسایی قرارمی گیرد.. DDBJ بانک ژنی دیگری است که توسط محققان ژاپنی طراحی شده و برای استفاده از آن می توان به سایت http://www.ddbj.nig.ac.jp مراجعه نمود. Doyle, et al, 1990 ) ).

دسته بندی : پایان نامه ارشد

پاسخ دهید